artur kwas szczecin

Zastosowaliśmy bezstronną metodę ilościowego obrazowania, która ułatwia pomiar dużej liczby prątków i ich powiązanie z określonymi markerami komórkowymi. Metoda ta omija powszechnie stosowaną, ale potencjalnie stronniczą, strategię kwantyfikacji, która wykorzystuje kontrolę wizualną do określenia dodatniego lub ujemnego związku bakterii z markerem. Obserwowaliśmy szeroki i niejednorodny zakres asocjacji katepsyny D (Figura 3A) i LAMP-2 (Suplementowa Figura 4) z M. tuberculosis i obliczyliśmy proporcję, która była związana z tymi markerami późnej endocytozy. W spoczynku hLEC tylko 26,7% (n = 2,272) (Figura 3B) i 21,6% (n = 1,029) (Suplementowa Figura 4B) M. tuberculosis WT znajdowały się odpowiednio w przedziale katepsyny D + lub LAMP-2 +. Przeciwnie, 79,0% (n = 1,414) M. tuberculosis . RD1 było w przedziale katepsyny D + (Figura 3B). Po zakażeniu M. tuberculosis . RD1: comp, wyższy odsetek bakterii był dodatni dla markerów późnej endocytozy w porównaniu z tym po zakażeniu WT M. tuberculosis, ale poziom był nadal znacząco niższy niż po zakażeniu M. tuberculosis. RD1 , wskazując częściowe uzupełnienie szczepu WT przez RD1. Rycina 3 Pozakomórkowa lokalizacja M. tuberculosis ujawnia heterogenną lokalizację w komórkach hLEC. (A) Reprezentatywne obrazy hLEC zakażonych M. tuberculosis WT, M. tuberculosis. RD1 lub M. tuberculosis. RD1: comp po 48 godzinach po zakażeniu w obecności lub nieobecności IFN-y. Obrazy pokazują bakterie wyrażające EGFP, endogenną katepsynę D. Alexa Fluor 546, F-aktynę znakowaną Alexa Fluor 633fallalloidin i DNA znakowane DAPI. Pasek skali: 10 .m. Oryginalne powiększenie, × 5 (wkładka). (B) Kwantyfikacja asocjacji katepsyny D z M. tuberculosis WT, M. tuberculosis. RD1 lub M. tuberculosis. RD1: comp z obrazów takich jak te w A w 48 godzin po zakażeniu. N jest całkowitą liczbą indywidualnych jednostek bakterii mierzonych w każdym stanie, a procenty odnoszą się do proporcji populacji katepsyny D + (tj. Populacji w każdej kropkowanej ramce). Paski błędów reprezentują średnią. SEM z 3 biologicznych powtórzeń. *** P <0,001, jednokierunkowa ANOVA z testem post-hoc Tukeya. (C) Przykładowe obrazy TEM przedstawiające obserwowaną lokalizację M. tuberculosis WT, M. tuberculosis . RD1 lub M. tuberculosis . RD1: comp w hLECs w 48 godzin po zakażeniu. Phagosome. reprezentuje bakterie z jedną otaczającą błoną gospodarza; . Cytosol. reprezentuje bakterie bez otaczających błon hosta; . Autofagosom. reprezentuje bakterie znalezione w 2 lub więcej otaczających błonach gospodarza; i. Lysosome. reprezentuje otoczoną błoną gospodarza wypełnioną pęcherzykami. Pasek skali: 500 nm. (D) Ilościowe oznaczenie M. tuberculosis WT, M. tuberculosis. RD1 lub M. tuberculosis. RD1: comp lokalizacje subkomórkowe w obrębie hLECs w 48 godzin po zakażeniu komórkami aktywowanymi (czerwone słupki) lub spoczynkowe (niebieskie słupki). Kwantyfikację przeprowadzono za pomocą stereologicznej analizy obrazów TEM fragmentów żywicy hLEC. Paski błędów reprezentują średnią. SEM z co najmniej 2 biologicznych powtórzeń. Podejrzewaliśmy, że niskie powiązanie późnych markerów endocytarnych / lizosomalnych z M. tuberculosis w hLEC było spowodowane tym, że bakterie zostały zatrzymane w fagosomach lub ponieważ uległy translokacji do cytozolu (13, 29). Przeanalizowaliśmy hLEC zakażone przez M. tuberculosis WT przez 24 godziny za pomocą oznaczenia immunogolderem EM LAMP-2 lub CD63 na rozmrożonych kriosekcjach Tokuyasu i zaobserwowano, że niektóre bakterie nie wydają się rezydować w komorze związanej z błoną (dodatkowa Figura 5A). Wykorzystując konwencjonalne osadzanie żywicy i transmisyjną mikroskopię elektronową, mogliśmy ustalić, że u hLECs M. tuberculosis może uciec przed fagosomem (Figura 3C i Suplementowa Figura 5B) [patrz też: pecherzyca, pluskwy ugryzienia, pekan ]