dermatologia przybyszewskiego poznań

Łącznie 3 x 105 komórek na studzienkę komórek CD14 + hodowano w 48-studzienkowej płytce przez 4 dni w RPMI 1640 zawierającym 10% FCS, 10% ludzkiej surowicy typu AB (Sigma-Aldrich) i 20 ng / ml makrofagów. CSF (R & D Systems). Komórki przemyto 2 razy HBSS i hodowano w świeżej pożywce przez 3 dodatkowe dni. PBMC (5 x 105 / studzienkę) rozdzielono na 48-studzienkową plastikową płytkę, a następnie zaszczepiono każdym wirusem przy MOI wynoszącym 0,01. MDM inkubowano z wirusem przy MOI wynoszącym 0,01 przez godzinę, a następnie przemyto dwukrotnie HBSS i hodowano w świeżej pożywce. Związana z wirusem aktywność RT supernatantu hodowli była okresowo monitorowana, jak już wcześniej opisano (49). Aby ocenić różnice między kinetyką replikacji SIVsmE543 a skonstruowanymi chimerycznymi klonami i mutantami, przeprowadzono 3 niezależne zestawy eksperymentów z PBMC i MDM otrzymanymi od dawców RhDCCW i RhMO3. Uzyskane dane znormalizowano jako procent maksymalnej wartości osiągniętej w każdym niezależnym eksperymencie. Analiza białka. Ilościowe pomiary wirusowego kapsydu p27 (CA) i białka gp120 w wirionach w celu określenia stosunku Gag / Env określono przy użyciu dwukolorowej fluorescencyjnej analizy białka żelowego, jak opisano wcześniej (27, 28). Pokrótce, klony SIVsmE543-3 i SIVsmE543CT ekspandowano w komórkach CEM, zatężono i oczyszczono i zbadano za pomocą SDS-PAGE. Dobrze scharakteryzowane preparaty referencyjne pochodzących z infekcji HIV-1 BAL, HIV-1 NL4-3 i SIVmac239 hodowanych w limfoblastoidach T ludzkich limfocytów TTT-CCR5 (dostarczone przez Jima Hoxie, University of Pennsylvania, Filadelfia, Pensylwania, USA) zostały włączone w analizie jako kontrole. Białko całkowite wybarwiono stosując SYPRO Ruby (Thermo Fisher Scientific), pozwalając na oznaczenie zawartości p27, a glikoproteinę wybarwiono SYPRO Pro-Q Emerald (Thermo Fisher Scientific), pozwalając na oznaczenie zawartości gp120. Zawartość Virion p27 / gp120 oznaczono ilościowo za pomocą analizy regresji liniowej przez wygenerowanie standardowych krzywych densytometrycznych z serią rozcieńczeń oczyszczonego p27 i pg120 o znanym stężeniu. Następnie obliczono stosunek Gag / Env dla każdej próbki. Ocena uwalniania cząstek wirusa. Wektory ekspresyjne pHA-ROD10 i pHA-ROD14-Env skonstruowano przez dodanie znacznika HA do C-końca plazmidu pCM10 i pCM14, jak opisano poprzednio (35). pHA-mac239-Env (SIVmac239), pHA-smE543-Env (SIVsmE543-3), pHA-E543 # (SIVsmE543CT # 1), pHA-E543 # 2 (SIVsmE543CT # 2), pHA-E543 # 3 (SIVsmE543CT # 3), pHA-E543 # 4 (SIVsmE543CT # 4) i pHA-E543 # 154 (SIVsmE543CT # 154) Konstrukty ekspresyjne Env wytworzono przez klonowanie amplifikowanych PCR pełnych sekwencji Env odpowiednich szczepów wirusowych przez flankujące XbaI i Miejsca restrykcyjne Xhol w odpowiednie miejsca w pCM10. Konstrukty ekspresyjne pHA-mac239-Nef (SIVmac239) i pHA-smE543-Nef (SIVsmE543-3) nef wytworzono przez klonowanie sekwencji nef amplifikowanych za pomocą PCR pełnej długości odpowiednich szczepów flankowanych z miejsc restrykcyjnych EcoRI i XhoI do odpowiadających im miejsc restrykcyjnych. miejsca wektora pCAG-HA (Addgene). Przeprowadzono testy pulsu i immunoprecypitacji, jak opisano wcześniej, z pewnymi modyfikacjami (40). Pokrótce, komórki 293T kotransfekowano wektorem ekspresyjnym rBST-2, Vpu usunięto plazmidem pNL4-3 (50) i jednym z odpowiednich wektorów ekspresyjnych Env znakowanych HA (ROD10 env, ROD14 env, SIVmac239 env, SIVmac239 nef, SIVsmE543-3 env, SIVsmE543-3 nef, SIVsmE543CT # env, SIVsmE543CT # 2 env, SIVsmE543CT # 3 env, SIVsmE543CT # 4 env lub SIVsmE543CT # 154 env) przy użyciu Lipofectamine z dodatkowym odczynnikiem (Thermo Fisher Scientific). Transfekowane komórki 293T znakowano pulsowo za pomocą transfekcji [35S] (Perkin Elmer) przez 30 minut i goniono w temperaturze 37 ° C w ml wstępnie ogrzanego DMEM-FBS przez 0, 2,5 i 5 godzin.
[przypisy: operacja kręgosłupa szyjnego, polipektomia, płatki jaglane właściwości ]