dr nojek wrocław

Komórka ES również ekspresjonuje specyficzny dla podocytu i indukowalny doksycykliną (indukowalny przez DOX) transaktywator (Nphsl-rtTA3G), który umożliwia indukowalną ekspresję shRNA (Figura 2A i odnośnik 43). Rozumowaliśmy, że indukowalne RNAi pozwolą nam zbadać rolę genu w dojrzałej nerce, nie martwiąc się o efekty rozwojowe. Nowa metoda wykorzystująca wspomagane laserem mikroiniekcję do zarodków 8-komorowych (44) pozwoliła nam wygenerować myszy, które były prawie w 100% otrzymane z komórek ES bez dalszego rozmnażania (Figura 2B). Zgodnie z myszami generowanymi przez konwencjonalną hodowlę, około 50% myszy wytworzonych z tych komórek ES rozwinęło łagodny białkomocz po 12 do 16 tygodniach życia (Figura 2C). Aby wyeliminować zmienność wprowadzoną przez losową integrację transgenu RNAi, celowaliśmy w pojedynczą kopię transgenu RNAi w mysie locus Hprt1 (45), które pozwala na zastosowanie 6-tioguaniny do wydajnej selekcji (Figura 3A). Rysunek 2Dopracowanie komórek ES uwrażliwionych na FSGS. (A) Identyfikacja wrażliwych na FSGS komórek ES. Nasza strategia hodowlana przewiduje, że jeden z 8 zarodków będzie miał prawidłowy genotyp. Komórki ES wytworzono przy użyciu standardowych podejść i genotypowano pod kątem heterozygotyczności Cd2ap (górny panel), transgenu NEFTA (środkowy panel) i chromosomu Y (dolny panel). (B) Myszy z wtryskiem lasera wytwarzają myszy o wysokim chimeryzmie. W pokazanym przykładzie linia komórek ES (agouti) została wstrzyknięta do zarodków 8-komórkowej C57 / BL6 (czarnej). W porównaniu z bezinuzowanymi zarodkami (powodującymi u myszy 2 czarne myszy pokazane na spodzie), wszystkie wstrzyknięte zarodki wytwarzały młode, które były bliskie czysto agouti. Wstrzyknięcie komórek ES do zarodków albinotycznych C57 / BL6 dało w wyniku zwierzęta całkowicie aguti (nie pokazano). (C) Myszy wytworzone z komórek ES rozwinęły łagodny białkomocz po 4 miesiącach, bez traktowania DOX. Piętnaście myszy wytworzono z uczulonych komórek ES i traktowano DOX z wodą lub bez niej w wodzie pitnej. Mocz testowano co miesiąc, mierząc stosunki albumin / kreatyniny. Myszy wytworzyły białkomocz o niskim poziomie w wieku 4 miesięcy, ale poziom DOI nie wpływał na poziom białkomoczu. Figura 3 Weryfikacja systemu z zastosowaniem knockdown CD2AP. (A) Strategia celowania stosowana do integracji transgenu miR30-shRNA do locus Hprt1. (B) Skuteczność knockdown dla miR30-shRNA dla Cd2ap (sh877). Immunoblot pokazuje endogenny CD2AP w komórkach NIH3T3 stabilnie transdukowanych FF3 (kontrolne shRNA) lub sh877. Weryfikacja sh877 jest pokazana na Dodatkowym rysunku 2A. Panel B przedstawia wiele eksperymentów (n = 3) przeprowadzonych w celu przetestowania wydajności RNAi. (C) Szesnaście myszy wytworzonych komórkami ES z shRNA Cd2ap, które były ukierunkowane na locus Hprt1, traktowano DOX lub bez niego, a mocz analizowano przez pomiar stosunku albumina / kreatynina w moczu w 4 i 8 tygodniu. (D) Histologia od reprezentatywnej myszy Cd2ap RNAi traktowanej DOX pokazującej odlewy białka (oznaczone gwiazdkami; n> 5). (E) Reprezentatywny obraz z mikroskopu elektronowego od myszy Cd2ap RNAi traktowanej DOX pokazuje wymywanie w stopie podocytów (FP). En, komórki śródbłonka (n = 9). (F) Trzynaście myszy kontrolnych wytworzono z kontrolnym RNAi lucyferazy skierowanym do locus Hgprt. Myszy traktowano (n = 6) lub bez (n = 7) DOX, a mocz analizowano mierząc stosunek albumina / kreatynina w 4 i 8 tygodniu. Do obliczenia wartości P w C i zastosowano dwu-ogonowy test U Manna-Whitneya. Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za statystycznie istotną. Ponieważ Cd2ap jest genem choroby FSGS (46), a nokaut (KO) u myszy rozwija się ciężka białkomocz (47), zwalidowaliśmy nasz system przez generowanie myszy Cd2ap RNAi. Wiele RNA specyficznych dla Cd2ap badano pod kątem ich zdolności do hamowania ekspresji Cd2ap (Figura 3B i Suplementowa Figura 2A), a RNAi wykazujące największe hamowanie (sh877) było wbudowane w sekwencję miR30, która pozwala na ekspresję indukowalną DOX (Suplementowa Figura 2). , B i C, i ref
[hasła pokrewne: szkoła podstawowa lubasz, gimnazjum lubasz, omega kleszczów ]