ewa med oława ginekolog

Jako kontrolę zastosowano RNAi dla genu lucyferazy świetlika (FF3). Połowa zwierząt założycieli (F0) była leczona DOX w wieku 2 tygodni w celu indukcji ekspresji transgenu shRNA. U wszystkich myszy leczonych DOX wystąpiło przedłużone białkomocz, który był ponad 150-krotnie wyższy niż u zwierząt kontrolnych (Figura 3C). Analiza histologiczna nerek wykazała odlewania białek w kanalikach (ryc. 3D). Badanie mikroskopowe nerki przeprowadzone na mikroskopie elektronowym wykazało powszechne usuwanie próchnicy, będące markerem białkomoczu (Figura 3E), potwierdzając, że nasza strategia RNAi może być wykorzystana do testowania genów FSGS kandydatów. Co ciekawe, myszy białkowe odzyskały po usunięciu traktowania DOX (dodatkowa figura 2D). Przeciwnie, myszy FF3-RNAi nie wykazywały białkomoczu po traktowaniu DOX przez 8 tygodni (Figura 3F) i nie wykryto żadnych nieprawidłowości w mikroskopie elektronowym lub histologii (dodatkowa Figura 2E). Walidacja WNK4, KANK1 i ARHGEF17 jako potencjalnych genów podatności na FSGS. Trzy z sześciu genów, WNK4, DLG5 i KAT2B, zidentyfikowane przez rzadką analizę wariantów wybrano do testów. Wybraliśmy również 3 pojedyncze warianty kandydatów: KANK1, WNK4 i ARHGEF17. Ponieważ WNK4 był obecny na obu listach, do analizy wybrano łącznie 5 genów. Ponieważ dokładny mysi ortolog dla ludzkiego KANK1 jest nieznany, ponieważ Kank2 jest bardziej eksprymowany w podocytach myszy (49), a ponieważ Kank1 i Kank2 zostały ostatnio zidentyfikowane jako geny podatności na zespół nerczycowy, celowaliśmy zarówno w Kank1, jak i Kank2. Dla sześciu genów kandydujących wygenerowano wiele shRNA. Ich skuteczność została potwierdzona in vitro, a najlepsza była ukierunkowana na locus Hprt1 (Figura 4A i dodatkowa Figura 3, A i B). Wybrano dwa niezależne klony dla każdego genu kandydującego, a 15. 30 myszy wygenerowano za pomocą mikroiniekcji wspomaganej laserem. Figura 4 Weryfikacja 5 kandydujących genów choroby FSGS. (A) Walidacja shRNA dla Arhgef17, Dlg5, Kank1, Kank2, Wnk4 i Kat2b. Jak opisano w Methods, shRNA testowano pod kątem zdolności do hamowania sekwencji docelowej połączonej z GFP w 293 komórkach. Do pomiaru stopnia hamowania stosowano immunoblot GFP. Każda immunoblot reprezentuje co najmniej 3 niezależne eksperymenty mierzące efektywność RNAi. (B. G) Testowanie walidacji myszy pod kątem potencjalnych genów FSGS. Komórki ES wytworzono przy użyciu specyficznych RNA skierowanych do locus Hgprt. Zasadniczo czyste chimeryczne myszy wytworzono za pomocą wspomaganej laserem mikroiniekcji komórek ES do zarodków 8-komórkowych C57BL6. Iniekcje spowodowały generalnie kohorty 14 do 30 zwierząt; mniejsze kohorty zwierząt nie były używane. Myszy podzielono na 2 grupy i traktowano DOX lub bez niego w celu indukcji ekspresji transgenu RNAi. Stężenie albuminy w moczu / kreatyniny mierzono 4 i 8 tygodni po podaniu DOX. Stosunki albumin / kreatyniny przedstawiono dla każdej kohorty myszy we wskazanych punktach czasowych. Dwu-ogonowy test U Manna-Whitneya zastosowano do obliczenia wartości P dla B. G. Wartość AP mniejsza niż 0,0083 została uznana za statystycznie istotną (zastosowano karę wieloraką). Połowa każdej kohorty otrzymała DOX, a białkomocz (albumina / kreatynina), wskaźnik funkcji podocytów, oceniano w 4 i 8 tygodniu po traktowaniu DOX (Figura 4, B. G). Wszystkie 3 transgenów RNAi, Wnk4, Arhgef17 i Kank2, wywołały znaczny białkomocz, z poziomem białkomoczu, który był znacząco wyższy niż obserwowany u myszy kontrolnych (Figura 4, B (EE). W przeciwieństwie do tego myszy Dlg5, Kat2b i Kank1 RNAi nie wykazały statystycznie istotnego wzrostu białkomoczu po 4 lub 8 tygodniach leczenia DOX. Ponieważ wystąpiła niewielka tendencja do zwiększenia białkomoczu u myszy Kat2b i Kank1, obserwowaliśmy poziomy białkomoczu przez dodatkowe 4 tygodnie
[podobne: płatki jaglane właściwości, orzechy włoskie kalorie, oparzenia pierwsza pomoc ]