fresenius kraków

Paski błędów reprezentują średnią. SEM z 3 replikatów biologicznych. (C) Wzrost (fluorescencja EGFP na komórkę) WT M. tuberculosis po 48 godzinach infekcji w komórkach kontrolnych (. Rapa) lub komórkach traktowanych 500 nM rapamycyną (+ Rapa) w spoczynku (niebieskie symbole) lub aktywacji (czerwone symbole ) warunki. Paski błędów reprezentują średnią. SEM z 3 replikatów biologicznych. NS = P> 0,05; * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, jednoczynnikowa ANOVA z testem post-hoc Tukeya. (D) Obrazy pobrane z obrazowania żywych komórek ekspresjonujących LC3-RFPa hLECs zakażonych WT M. tuberculosis przez 5 dni w warunkach spoczynku. Pasek skali: 10 .m. Fluorescencję GFP wykreślono, aby pokazać wzrost bakterii w przedziale LC3 +. Struktura została przeniesiona do seryjnej analizy SEM metodą blokowo-blokowej z wykorzystaniem korelacyjnego przepływu pracy, a seryjne obrazy elektronowe zostały ręcznie posegmentowane i renderowane w celu utworzenia modelu 3D bakterii (zielony) i membrany ograniczającej (czerwony). Pasek skali: 2,5 m. Zobacz także Supplemental Videos 2 i 3. Postawiliśmy hipotezę, że M. tuberculosis wzrastał w komórkach autofagicznych LC3 + w komórkach spoczynkowych. Aby to przetestować, opracowaliśmy podejście korelacyjnej mikroskopii świetlnej i mikroskopii elektronowej (CLEM), wykorzystujące obrazowanie z żywych komórek, które pozwoliło nam określić zależność między kompartmentami LC3 + na poziomie ultrastrukturalnym a wzrostem żywych bakterii. Stwierdziliśmy, że M. tuberculosis w przedziałach LC3-RFP aktywnie rosła w spoczynkowych komórkach hLEC (Figura 5D). Bakterie rosnące w ciągu 5 dni były zlokalizowane w ultrastrukturalnie bardzo złożonym przedziale LC3-RFP + zawierającym wiele błon i pęcherzyków (Figura 5D i Supplemental Videos 2 i 3). Doszliśmy do wniosku, że autofagia może zarówno promować, jak i ograniczać wzrost bakterii, w zależności od stanu aktywacji. Produkcja NO ogranicza wzrost M. tuberculosis w aktywowanych hLEC. Najszybszy okres wzrostu M. tuberculosis w komórkach hLEC odpowiadał jej przesunięciu do lokalizacji cytosolowej (ryc. 2E i ryc. 3D). Chociaż celowanie autofagiczne może ograniczać wzrost bakterii (Figura 5, A (C), subpopulacja M. tuberculosis skierowana na autofagosomy w dowolnym czasie była stosunkowo mała (Figura 4D). W związku z tym zbadaliśmy możliwość, że inny mechanizm gospodarza zależny od IFN-a może działać w cytozolu, aby kontrolować wzrost bakterii. Innym rozważanym mechanizmem zabijania bakterii było generowanie NO przez hosta. LEC wyrażają zarówno indukowalny NOS (iNOS), jak i śródbłonkowy NOS (eNOS) (19). Za pomocą markera dioctanu DAF-FM, który staje się fluorescencyjny po reakcji z NO, wykryliśmy zwiększone poziomy wewnątrzkomórkowego NO w hLECs po IFN-y. aktywację, a działanie blokowano stosując inhibitor NOS l-NG-cytrynian monometyl argininy (1-NMMA) (Figura 6A). Wzrost produkcji NO nie był spowodowany zmianami w ekspresji enzymów, ponieważ poziomy iNOS i eNOS pozostały podobne, zarówno po IFN-y aktywacja lub infekcja (Figura 6B). Nie zaobserwowaliśmy żadnego zależnego od IFN-a wpływu na fosforylację eNOS (dane nie pokazane). Zasadniczo zaobserwowaliśmy, że eNOS kolokalizował się z M. tuberculosis w komórkach aktywowanych IFN-3 3 razy częściej niż w komórkach spoczynkowych (Figura 6, C i D). Kolokalizację obserwowano tylko na poziomach tła z iNOS w komórkach aktywowanych lub spoczynkowych (Figura 6, C i D). To sugeruje, że IFN-y może ułatwić ukierunkowanie istniejących puli wewnątrzkomórkowych eNOS na M. tuberculosis. Co ważne, zahamowanie wytwarzania NO przez 1-NMMA zniosło efekt IFN-y w ograniczaniu wzrostu M. tuberculosis po 48 godzinach od zakażenia, podczas gdy tego efektu nie obserwowano w komórkach zakażonych M. tuberculosis. RD1 (Figura 6E). Ponadto zaobserwowaliśmy, że leczenie 1-NMMA hamowało wzrost szczepów, które miały dużą część bakterii związanych z błoną, co sugeruje, że NOS mogą wpływać na populacje związane z błoną w inny sposób [patrz też: orzechy włoskie kalorie, płesznik, szkoła podstawowa lubasz ]