korycka stomatolog bolesławiec

Alternatywnie, mogą to być różnice w epistatycznych interakcjach pomiędzy Cd2ap / Synpo i Kank1 w porównaniu z Kank2. Jak wykazaliśmy u myszy Kank1 RNAi, nasz system jest potencjalnie bardziej wrażliwy, jeśli zastosowano dłuższy okres skriningu. Ponieważ białkomocz i FSGS zaczynają się pojawiać u myszy w wieku od 4 do 6 miesięcy, celowo zaprojektowaliśmy ekran do skończenia po 8 tygodniach ekspresji RNAi. Nasza metoda jest zasadniczo podobna do tej opisanej przez Premsrirut i in. skierował shRNA do locus Col1a1 przy użyciu komórek ES opracowanych przez Jaenischa i współpracowników. Te komórki ES wyrażały rtTA wszędzie z miejsca Rosa (58, 59). Pierwotnie próbowaliśmy tej metody i stwierdziliśmy, że transgenów ukierunkowanych na locus Col1a1 były słabo wyrażone w podocytu (dane nie pokazane). Ponadto w naszej metodzie wykorzystano linię komórek ES ze światłoczułego tła, co pozwoliło nam dostosować nasz ekran do FSGS. Nasza metoda różni się od metody Premsrirut i wsp., Która stosowała tetraploidalne uzupełnienie, które jest znacznie bardziej pracochłonne i wytwarza o wiele mniej transgenicznych zwierząt (59). Zdolność do pozyskiwania komórek ES z różnych środowisk podatnych na choroby powinna sprawić, że nasze podejście będzie odpowiednie dla szerokiej gamy modeli chorób. Wraz z dostępnością sekwencjonowania DNA na dużą skalę w populacjach ludzkich, identyfikacja genów kandydujących do choroby i potencjalnych wariantów związanych z chorobą stanie się bardziej powszechna. Sposób, w jaki te potencjalne geny i warianty zostaną zwalidowane, jest niejasny. Tutaj pokazujemy rurociąg, który wykorzystuje wspólne i rzadkie analizy asocjacji wariantów w celu zidentyfikowania potencjalnych genów ze sporadycznie dotkniętych niespokrewnionych osobników i danych sekwencji kontrolnej, które zostały wcześniej wygenerowane. Następnie opracowaliśmy metodę umożliwiającą testowanie tych kandydatów in vivo. Nasza metoda polegała na generowaniu linii komórek ES uwrażliwionych na rozwój FSGS. Powinno być możliwe wytwarzanie komórek ES na innych specyficznych dla choroby podłożach, aby umożliwić przeprowadzenie badań walidacyjnych, które będą wymagane w celu ułatwienia odkrycia wariantów genetycznych związanych z rzadkimi i powszechnymi chorobami. Metody Przechwytywanie Exon i sekwencjonowanie Illuminy. Przygotowanie próbki i sekwencjonowanie przeprowadzono z użyciem standardowych protokołów do ukierunkowanego wychwytywania i sekwencjonowania Illumina. W skrócie, genomowe DNA fragmentowano do 150 do 200 pz przy użyciu ogra- niczonego ultradźwiękowego Covaris E220. Końce fragmentowanego DNA naprawiono przy użyciu mieszaniny polimerazy DNA T4, polimerazy Klenowa i kinazy polinukleotydowej T4. Następnie adaptery do sekwencjonowania Illumina zligowano z fragmentami. Biblioteki te następnie hybrydyzowano z sondami biotynylowanego DNA z regionów zainteresowania (wytwarzanych przez MyGenostics). Po wymyciu bibliotek DNA, które wiążą się niespecyficznie z sondami, DNA będący przedmiotem zainteresowania odzyskano stosując Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (Life Technologies). Powstałe biblioteki DNA zostały w razie potrzeby zamplifikowane do sekwencjonowania na Illuminie HiSeq 2500. Wywoływanie wariantów i kontrola jakości danych. Przeprowadziliśmy wyrównanie surowych danych sekwencjonowania i wywoływanie wariantów zgodnie z najlepszymi praktykami GATK za pomocą oprogramowania BWA / Picard / GATK w Broad Institute. Aby upewnić się, że loci genów zostały w równym stopniu uwzględnione zarówno u pacjentów, jak i u osób z grupy kontrolnej, przeprowadziliśmy kontrolę jakości u pacjentów. i kontrole. osobno dla genotypów, stosując następujące filtry: (a) zachowanie tylko wariantów, które PRZEPASUJĄ wszystkie filtry jakości GATK; (b) zatrzymanie genotypów z DP> 10, GQ> 30, AB dla hets 0.3