leczenie uzależnień szklarska poręba

Zaobserwowaliśmy podobny wzór dystrybucji znaczników i, w niektórych grupach zainfekowanych komórek, byliśmy w stanie skorelować ZN z barwieniem fluorescencyjnym M. tuberculosis (dane nie pokazane). Skrawki tkanek inkubowano w temperaturze pokojowej przez godzinę z pierwotnymi przeciwciałami rozcieńczonymi w PBS. Po 3 przemyciach w PBS, fluorescencyjnie znakowane drugorzędowe przeciwciała inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Skrawki przemywano 4-krotnie PBS i inkubowano przez 10 minut z DAPI, a następnie nakładano szkiełka nakrywkowe za pomocą DAKO Medium montażowego. Próbki obrazowano za pomocą mikroskopu konfokalnego skanującego laser Olympus Fluoview 500 lub Leica SP5. Trójkolorowe obrazy (czerwony, zielony i daleki czerwony [pseudokolorowy jako niebieski]) zostały pozyskane sekwencyjnie, a następnie obraz DAPI (szary) pokazujący jądra. Obrazy zostały pozyskane i zapisane jako obrazy w formacie TIFF. Obrazy zostały przetworzone za pomocą Fidżi i Adobe Photoshopa w celu odjęcia tła i obrazów splotu za pomocą funkcji gaussowskiej w celu zmniejszenia szumów obrazu. W przypadku analizy półilościowej zliczono co najmniej 100 komórek na pole widzenia, przy czym średnia wynosiła 200 komórek. Analizowano co najmniej 10 pól widzenia na sekcję na próbkę. Hodowlę komórkową. Pierwotne hLEC pobrane z pachwinowych węzłów chłonnych (ScienCell Research Laboratories, 2500) hodowano zgodnie z instrukcjami producenta aż do pasażu 5. W skrócie, kolby T-75 powleczono roztworem 2. G / cm2 ludzkiej fibronektyny (Sigma. Aldrich, F1141) w jałowym PBS (Life Technologies, 70013) i inkubowano przez noc w 37 ° C. hLECs wysiewano przy gęstości 5000 komórek / cm2 i hodowano z pożywką komórek śródbłonka (ECM) (ScienCell Research Laboratories, 1001) uzupełnionym 1% (v / v) suplementem wzrostu komórek śródbłonka (ScienCell Research Laboratories, 1052) i 5% (v / v) FBS (ScienCell Research Laboratories, 0025) w 37 ° C z 5% CO2. Pożywkę hodowlaną wymieniano co 2 dni, aż komórki osiągnęły 70% konfluencji; następnie pożywkę wymieniano codziennie aż do 90% konfluencji, po czym komórki wykorzystano do eksperymentowania lub pasażowania zgodnie z instrukcjami producenta. Różne liczby hLEC zasiano w zależności od rodzaju eksperymentu, ale na ogół do eksperymentu użyto konfluencji około 90%, a komórki wysiano na 16 godzin przed użyciem. W przypadku mikroskopii konfokalnej utrwalonych próbek hLEC zaszczepiono w ilości 20000 komórek na studzienkę w 300 ul ECM na szkiełkach nakrywkowych szklanych o średnicy 10 mm wykonanych z fibronektyny o grubości # 1,5 (Glaswarenfabrik Karl Hecht, 1001 / 10_15) umieszczonych w studzienkach 24-studzienkowych płyta. W celu analizy CFU lub zbierania supernatantów, hLEC wysiano przy 20000 komórek na studzienkę w 300 ul ECM na dołki traktowane fibronektyną płytki 24-studzienkowej. W celu wytworzenia próbek dla Western blot lub dla próbek do wbudowania w płaskie komórki, hLEC zaszczepiono na 300 000 komórek na kolbę T-25 traktowaną fibronektyną w 5 ml ECM. Do obrazowania na żywo w komórce użyto 30 000 komórek w 500. L ECM na szklane dno 35-mm z żywymi komórkami (WillCo Wells, GWst-3512) potraktowane fibronektyną, z wyjątkiem przypadku obrazowania żywych komórek za pomocą CLEM, w którym wymagana była znacznie mniejsza zbieżność (30%. 50% było optymalne). W tym przypadku 10 000 komórek w 500. L ECM wysiewano na szklane dno ze szklanymi dnem poddane obróbce fibronektyną (MatTek, P35G-2-14-CGRD). Informacje o izolowaniu i hodowli ludzkich makrofagów podano w Dodatkowych metodach. Szczepy bakteryjne i kultura. M. tuberculosis H37Rv, M. tuberculosis H37Rv. RD1 i M. tuberculosis H37Rv. RD1 :: RD1 transformowano integrującym wektorem ekspresyjnym EGFP pML1335 (dostarczonym przez M. Niederweis, University of Alabama, Birmingham, Alabama, USA) w celu utworzenia szczepy określone w tym badaniu jako M tuberculosis WT, M. tuberculosis. RD1 i M. tuberculosis. RD1: comp, odpowiednio. M. bovis Szczep BCG Pasteur 1173P2 eksprymujący GFP dostarczyła Brigitte Gicquel (Pasteur Institute, Paryż, Francja). Wszystkie szczepy poddano sekwencjonowaniu w pełni genomu w celu potwierdzenia ich tożsamości przed użyciem. Mycobacteria hodowano w pożywce bulionowej Middlebrook . 7H9 (Sigma-Aldrich, M0178) uzupełnionej 10% (v / v) Middlebrook OADC (BD Biosciences, 212351) i 0,05% (v / v) Tween80 (Sigma-Aldrich, P1754). i inkubowano w 37 ° C z obrotami w 50 ml probówkach Falcon (hodowle do 10 ml) lub butelkach obrotowych (hodowle do 50 ml). Mycobacteria hodowano również na podłożu agarowym Middlebrook . 7H11 (Sigma-Aldrich, M0428) uzupełnionym 10% (v / v) Middlebrook OADC i inkubowano w 37 ° C przez 2 do 3 tygodni aż do pojawienia się kolonii. Zakażenie hLEC za pomocą probówki M.
[hasła pokrewne: pęcherzowe oddzielanie się naskórka, gimnazjum w lubaszu, ph metria ]