Ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 w nasieniu mężczyzn otrzymujących wysoce aktywną terapię przeciwretrowirusową ad

Komórki nasienne oddzielono od płynu nasiennego przez odwirowanie przy 500 x g przez 10 minut w 4 ° C. Związane z komórkami poziomy prowirusowego DNA HIV-1 i poziomy RNA związane z wirionem mierzono jak opisano poprzednio. 20-22 Aby oddzielić wiriony od plazmy i płynu nasiennego, próbki odwirowano przy 150 000 xg przez jedną godzinę. RNA wyizolowano z granulek kwasem ekstrakcyjnym z tiocyjanianem-fenolem i chloroformem.23 DNA ekstrahowano z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i komórek nasiennych za pomocą standardowej metody20. Sekwencje DNA i RNA gag HIV-1 wykryto za pomocą zestaw starterów-sond SK38, SK39 i SK19.20-22 Gen .-globiny oznaczono ilościowo w DNA z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej i komórek nasiennych za pomocą testu PCR z PCO3 i PCO4 jako parą starterów, jak opisano wcześniej , 20-22 jako kontrola obciążenia, w celu potwierdzenia, że każda próbka zawierała podobne ilości DNA przed rozpoczęciem PCR. Znakowane fosforu-32 Southern bloty tych mieszanin PCR oznaczono ilościowo za pomocą PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Wyniki Southern blotting próbek pacjentów porównano z wynikami dla ekstraktów z komórek ACH-2, linia komórek T, która zawiera jeden zintegrowany genom wirusa HIV-1 na komórkę do testu DNA PCR, 24 do ilościowego oznaczenia prowirusowego DNA oraz z konstruktem RNA gag HIV-1 transkrybowanym in vitro do testu RT-PCR22 w celu ilościowego oznaczania wirionów RNA. Dwóch zdrowych mężczyzn badano jako kontrole negatywne, aby wykluczyć krzyżowe zanieczyszczenie próbek. Testy kokulturowe
Limfocyty T CD8 zostały zubożone z wyizolowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej przez wiązanie z perełkami magnetycznymi skoniugowanymi z przeciwciałem anty-CD8 (Biosource, Camarillo, CA). Ten proces zmniejsza frakcję limfocytów T CD8 w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej od około 20 do 30 procent do 3 do 5 procent, jak analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Wyciek limfocytów T CD8 znacznie zwiększa wzrost in vitro HIV-1 z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej17-19, ponieważ komórki CD8 wydzielają chemokiny i inne czynniki hamujące replikację wirusa.25 Makrofagi i ich prekursory zostały pozbawione krwi obwodowej komórki jednojądrzaste przez inkubację próbek przez noc, aby umożliwić komórkom przyłączenie się do plastikowych płytek. Pozostałe limfocyty krwi obwodowej stymulowano następnie 5 .g fitohemaglutyniny na mililitr (Sigma, St. Louis) i 50 U interleukiny-2 na mililitr (GIBCO-BRL, Grand Island, NY). Limfocyty krwi obwodowej izolowano z próbek krwi pobranych od zdrowych osób przy zastosowaniu tej samej procedury. Limfocyty krwi obwodowej od pacjentów były następnie mieszane w stosunku 1: z normalnymi osobnikami (po 2 miliony komórek) i hodowane w pożywce RPMI-1640 z 10% płodową surowicą cielęcą i penicyliną i streptomycyną w 37 ° C. ° C przez sześć tygodni. Dwa razy w tygodniu połowę pożywki zastępowano świeżą pożywką, a raz w tygodniu połowę komórek zastępowano 2 milionami świeżych limfocytów krwi obwodowej od zdrowych osobników po stymulacji fitohemaglutyniną i interleukiną 2 oraz zmniejszeniem limfocytów T CD8.
Pelet z komórkami nasiennymi przemyto dwukrotnie zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanem, a 3 miliony komórek zmieszano z 2 milionami limfocytów krwi obwodowej od zdrowych osobników po zubożeniu limfocytów T CD8 i stymulacji fitohemaglutyniną i interleukiną-2.
[patrz też: Białkomocz, bromazepam, suprasorb ]
[hasła pokrewne: citalopram, dygestorium, designerskie wieszaki ]
[przypisy: penire plus opinie, ph metria, picie oleju lnianego ]