Ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 w nasieniu mężczyzn otrzymujących wysoce aktywną terapię przeciwretrowirusową cd

Po 24 godzinach komórki przemyto trzy razy solanką buforowaną fosforanem i hodowle utrzymywano w obecności interleukiny-2 (10 U na mililitr) przez sześć tygodni. Dwa razy w tygodniu połowę pożywki zastępowano świeżą pożywką, a raz na tydzień komórki uzupełniano 2 milionami świeżych, leczonych limfocytów krwi obwodowej od normalnych osobników. Antygen p24 HIV-1 mierzono w supernatantach za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) (Dupont, Wilmington, Del.). Wszystkie procedury przeprowadzono w warunkach bezpieczeństwa biologicznego poziomu P3, aby zminimalizować możliwość zanieczyszczenia krzyżowego. Analizy sekwencji DNA
Sekwencje pętli V3 regionu gp120 wirusowej otoczki (env), proteazy i genów RT HIV-1 zostały określone przez nested PCR test obu prowirusowych DNA (bezpośrednio z próbek krwi obwodowej i komórek nasiennych) i otoczonego wirionem RNA (z replikacji wirusa w kokulturze). Wirusowy RNA poddano odwrotnej transkrypcji antysensownym zewnętrznym starterem, a komplementarny DNA (cDNA) amplifikowano za pomocą PCR. Drugą PCR przeprowadzono z parą primerów wewnętrzną do pary primerów użytej w pierwszej PCR, a zamplifikowany DNA wyizolowano z żeli agarozowych i analizowano przez sekwencjonowanie za pomocą automatycznego sekwencera (model Prism 377, z ulepszeniem XL, Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia). Jeśli wystąpiły zmiany w sekwencjach, fragmenty PCR klonowano do wektora pGEM-T (Promega, Madison, Wis.). Wiele klonów wyselekcjonowano z DNA komórek nasiennych i komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, a także z cDNA z replikacji wirusowego RNA i przeanalizowano sekwencje. Zewnętrzna para primerów dla pętli V3 regionu gp120 otoczki wirusowej to KK30 i KK40, a wewnętrzna para starterów to KK10 i KK20, jak opisano powyżej.26 (Sekwencje zostały zdeponowane w bazie danych GenBank pod numerami akcesyjnymi AF098718 do AF098734.)
Oznaczanie fenotypu wirusowego
W celu określenia fenotypów wirusa wyizolowano wirusowe izolaty z współhodowli na limfocytach T MT-2 i ludzkich makrofagach (zawierających 250 .g równoważników antygenu p24 HIV-1 na mililitr). Makrofagi izolowano z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od zdrowych osobników, jak opisano wcześniej.22 Wzrost wirusa w komórkach MT-2 określono na podstawie tworzenia syncytium i wytwarzania antygenu p24 w hodowli. Wzrost HIV-1 w makrofagach określono na podstawie wykrycia antygenu p24 w supernatantach hodowli metodą ELISA (Dupont).
Wyniki
Wykrywanie DNA prowirusowego HIV-1 związanego z komórkami
Tabela 1. Tabela 1. Charakterystyka kliniczna i wirusologiczna siedmiu mężczyzn z zakażeniem HIV-1. Ryc. 1. Ryc. 1. Wykrywanie DNA prowirusowego w komórkach nasiennych i jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej siedmiu mężczyzn z zakażeniem HIV-1. Komórkowy DNA ekstrahowano z komórek nasiennych i komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) i amplifikowano za pomocą PCR, z gag SK38 i SK39 jako parą starterów. W celu potwierdzenia, że każda próbka zawierała podobne ilości DNA przed PCR, DNA .-globiny również było amplifikowane w każdej próbce, z PCO3 i PCO4 jako parą starterów.20-22 Standardy DNA HIV-1 zostały przygotowane z ACH- 2 komórki (linia komórek T z jednym zintegrowanym genomem HIV-1 na komórkę) 24 i zamplifikowano za pomocą PCR w tym samym czasie, co próbki od pacjentów; wartości podano jako liczbę kopii na milion komórek
[hasła pokrewne: celiprolol, cilostazol, atropina ]
[więcej w: ambrisentan, blachodachówka gontopodobna, żeliwo szare ]
[podobne: płatki jaglane właściwości, płesznik, pluskwy ugryzienia ]