nawrót gorączki

Nasz ostateczny zbiór danych zawierał 16 108 SNP w 1874 genach. Dane sekwencjonowania zostały zdeponowane w archiwum NCBI. Sequence Read Archive (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/), pod numerem dostępu SRP067711. Dopasowanie PCA i case-control. PCA wykonano przy użyciu oprogramowania Eigenstrat, stosując typowe (MAF> 5%) warianty występujące tylko w autosomach. Obliczyliśmy odległość euklidesową od każdego punktu na wykresie PCA do początku i wykreślone rozkłady tego parametru dla pacjentów i kontroli. Stosując regułę 3-sigma, 30 próbek mieszanego pochodzenia latynoskiego zidentyfikowano jako wartości odstające i usunięto z zestawu danych. Przykładowe statystyki i kontrolne wielkości liter zostały porównane przy użyciu oprogramowania do analizy PLINK / SEQ. Użyliśmy liczby wariantów na próbkę, liczby heterozygotycznych genotypów na próbkę i liczby genotypów z mniejszym allelem na próbkę jako metryki reprezentującej tło genetyczne kohorty. Podobieństwo tła genetycznego pacjentów i kontroli ustalono, dopasowując średnią i wariancję dla rozkładów pacjentów i kontroli dla każdej metryki. Przetestowaliśmy poprawność tego podejścia, przeprowadzając dokładny test Fishera na wspólnej wariacji i wykresie QQ wartości P. Nie wykazało to żadnej inflacji, co potwierdziło brak stratyfikacji populacji w zestawie danych kontroli spraw (Supplemental Figure 1). Odmiany myszy. Cd2ap + /. myszy zostały wcześniej wygenerowane (47). Synpo. /. myszy uzyskano z laboratorium Petera Mundela (60). Szczep Nphs1-rtTA3G (NEFTA) był prezentem z laboratorium Jeffrey a Minera (43). Dlg5 + /. szczep myszy był prezentem z laboratorium Valeriego Vasioukhina (50). Wszystkie szczepy myszy genotypowano według ustalonych metod. Wytwarzanie męskiej linii komórkowej Cd2ap + / y, Synpo + / y, NEFTA + ES. Aby wytworzyć męską linię komórkową ES, która została uwrażliwiona na FSGS, wyhodowaliśmy Cd2ap + /. Synpo. /. mężczyźni z samicami NEFTA +. Samice poddano superowulacji przy użyciu standardowych metod. Po krzyżowaniu zarodki izolowano w stadium 8-komórkowym (morula) i hodowano przez noc w pożywkach EmbryoMax KSOM (MR-121-D, EMD Millipore) z dodatkiem oleju mineralnego przy 5% CO2 i 37 ° C. Blastocysty przeniesiono, na studzienkę, na 48-studzienkowe płytki z napromieniowanymi mysim promotorami zarodkowej fibroblastów (MEF) i standardowymi podłożami komórek ES zawierającymi 15% FBS kwalifikowaną do ES (SH30070.03E, Hyclone). Wewnętrzną masę komórkową (ICM) pozwolono wyrosnąć i trypsynizowano po 5 do 7 dniach, w zależności od wielkości i kształtu odrostu. Komórki hodowano aż do zidentyfikowania kolonii ES. Kolonie rozszerzono i genotypowano przy użyciu standardowych metod. Generowanie transgenicznych myszy knockin miR30-shRNA. Integrację transgenu pojedynczej kopii do locus Hprt1 przy użyciu 6-tioguaniny przeprowadzono jak opisano wcześniej (45) i zmodyfikowano przez dodanie kasety oporności na puromycynę w celu zwiększenia skuteczności selekcji pozytywnego klonu ES. Kasetę PGK-Puro wstawiono pomiędzy lewe i prawe ramię wektora kierującego pHPRT. Transgen eksprymujący shRNA oparty na miR30, który był napędzany przez promotor reagujący na tetracyklinę (TRE) wstawiono między lewe ramię i kasetę PGK-Puro. Linearyzowany wektor celujący transfekowano do komórek ES. Dwadzieścia cztery godziny po transfekcji komórki ES traktowano ug / ml puromycyny przez 48 godzin. Po jednokrotnym pasażowaniu komórki ES traktowano 6-tioguaniną (5 ug / ml) przez dodatkowe 48 godzin. Przeżywane kolonie komórek ES selekcjonowano, ekspandowano i badano za pomocą genomowej PCR przez prawe ramię (starter do przodu: 5a-CAGCCCGGTGCCTGATCTAGATCATATAT-3 (3, starter odwrotny: 5a-CTGTAAAGGTCTCTGAACTACCAATTGCAC-3 (3)). Pozytywne komórki ES następnie zapakowano do iniekcji. Mikroiniekcja wspomagana laserem Komórki ES utrzymywano w fazie ekspansji przed wstrzyknięciem. Osiem komórek ES wstrzyknięto do zarodka biorcy w stadium 8 komórek, postępując według opublikowanego wcześniej protokołu (44). Ponieważ linia komórek ES wytwarza myszy o kolorze agouti, myszy jako albino B6 (C57BL / 6J-Tyrc2JJ) zastosowano jako gospodarze dla umożliwienia bezpośredniej oceny chimeryzmu według barwy sierści. Hodowla komórek i infekcja lentiwirusowa. Unieśmiertelniony
[patrz też: oparzenia pierwsza pomoc, omega kleszczów, polipektomia ]