reumatolog złotów

Uzyskany produkt PCR następnie strawiono enzymami restrykcyjnymi Hindlll i Bglll, a fragment z chimeryczną sekwencją gp41 / nef / LTR wprowadzono z powrotem do odpowiedniego regionu SIVsm804E CL7E7. Konstrukcja SIVsmE543 z substytucjami aminokwasowymi w ogonie cytoplazmatycznym gp41. Aby uzyskać SIVsmE543CT nr 1, 543CT nr 2, 543CT nr 3 i 543CT nr 4, przeprowadzono 8 zestawów reakcji 2-PCR w celu wprowadzenia mutacji do ogona cytoplazmatycznego WT SIVsmE543-3. Fragment zawierający ogon cytoplazmatyczny gp41 amplifikowano za pomocą polimerazy DNA Fcu-dechem II przy użyciu niedopasowanych primerów wymienionych w Tabeli 2. Tabela 2. Reakcje zostały sparowane odpowiednio ze starterami Hind-R lub Bgl-F. Następnie każdą parę produktów PCR poddano annealingowi i zastosowano jako matrycę do drugiej rundy PCR, stosując zestaw Platinum Taq Hi Fidelity Kit, stosując startery Bgl-F i Hind-R. Powstałe fragmenty ze zmutowanymi ogonami cytoplazmatycznymi gp41 poddano klonowaniu TA do wektora pCR4-TOPO przy użyciu zestawu do klonowania TA. Otrzymane konstrukty trawiono enzymami restrykcyjnymi Hindlll i Bglll i podstawiono w odpowiadający region plazmidu WT SIVsmE543-3. W celu uzyskania SIVsmE543CT nr 154 przeprowadzono mutagenezę ukierunkowaną, jak wyjaśniono powyżej. Pierwszą reakcję PCR przeprowadzono z użyciem plazmidu SIVsmE543-3 jako matrycy. Dwie kolejne (2 i 3) PCR przeprowadzono przy użyciu produktu PCR z poprzedniej reakcji. Wszystkie końcowe konstrukty zostały zweryfikowane przez analizę sekwencji. Zapasy wirusa. Zapasy wirusa uzyskano przez transfekcję komórek 293T (program odczynników AIDS, katalog 103) za pomocą pełnej długości klonów molekularnych z użyciem odczynnika do transfekcji Fugene 6 (Promega). Supernatanty zebrano 48 godzin po transfekcji i poddano krioprezerwacji w <80 ° C aż do użycia. Surowiec wirusowy SIVsm804E przygotowano jak opisano wcześniej (15). W skrócie, przygotowano zawiesinę pojedynczych komórek z mózgu makaka rezus, który rozwinął ciężką postać SIVE przed sekcją. Tę zawiesinę pojedynczych komórek następnie hodowano razem z jednojądrzastymi komórkami krwi obwodowej (PBMC) wyizolowanymi z makaków rezusów nietraktowanych na SIV. Supernatanty z hodowli zbierano co 3 dni, do 18 dni, a materiał podstawowy o najwyższej aktywności RT kriokonserwowano w temperaturze ~ 80 ° C jako zapas wirusa. 50% zakaźną dawkę hodowli tkankowej (TCID50) wszystkich zapasów wirusa mierzono za pomocą testu TZM-bl, jak opisano w innym miejscu (47). Analiza sekwencji. Sekwencje env sekwencji wirusa SIVsmH445, SIVsmH631Br i SIVsmH783Br scharakteryzowano w poprzednim badaniu metodą amplifikacji pojedynczego genomu (15, 48). Sekwencję Env wirusa wirusa SIVsm804E scharakteryzowano jak opisano wcześniej (14). W skrócie, całkowity RNA wyekstrahowano ze szczepu wirusa, a odwrotną transkrypcję przeprowadzono za pomocą systemu ThermoScript RT-PCR (Thermo Fisher Scientific) z użyciem startera 9341-R (patrz dodatkowa tabela dla sekwencji starterów). PCR przeprowadzono na produkcie cDNA za pomocą zestawu Platinum Taq Polymerase High Fidelity Kit, stosując następujące startery: 6463-F i 9341-R. Produkt PCR następnie sklonowano do wektora TOPO i zsekwencjonowano. Testy infekcyjne. Replikację wirusa w izolatach oceniano w PBMCs i MDM rezus makaka, jak opisano wcześniej (14, 15). PBMC z nieżywych na SIV, zdrowych makaków rezus oddzielono od pełnej krwi, stymulowano 5 ug fitohemaglutyniny (PHA) na ml i 10% IL-2 (Advanced Biotechnologies) przez 3 dni i utrzymywano w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% FCS i 10% IL-2. MDM z Rhesus zostały uzyskane z PBMC rezusa makaka, jak opisano wcześniej (15). Pokrótce, świeże PBMC inkubowano z perełkami magnetycznymi CD4 anty-nie pochodzącymi od innych niż człowiek (Miltenyi Biotec) i pozytywnie dobierano z kolumnami do rozdzielania MACS (Miltenyi Biotec) [więcej w: omega kleszczów, oparzenia pierwsza pomoc, pokrzywka objawy ]