sułkowskiego 58 bydgoszcz

Następnie zbadaliśmy, czy M. tuberculosis może replikować się wewnątrzkomórkowo, wykorzystując obrazowanie żywych komórek. Obserwowaliśmy wzrost wewnątrzkomórkowego WT M. tuberculosis przez 6,5 dni za pomocą obrazowania żywych komórek i ustalono, że M. tuberculosis replikuje się wewnątrzkomórkowo, z czasem podwajania wynoszącym około 36 godzin (Figura 2D i Suplementacja Wideo 1), wykreślając intensywność sygnału EGFP. z biegiem czasu. Antybakteryjna rola IFN-y przeciwko M. tuberculosis ma ugruntowaną pozycję w makrofagach, a IFN-y jest również znany jako silny aktywator hLEC (25). Po potwierdzeniu, że hLEC reagowały na IFN-y in vitro, na co wskazywała ekspresja 2,3-dioksygenazy indolaminy i wytwarzanie IP-10 (Suplementowa Figura 2B), badaliśmy rolę IFN-y w sprawie zakażenia M. tuberculosis (Figura 2E). Potwierdzając wyniki z obrazowania żywych komórek, stwierdziliśmy, że M. tuberculosis replikuje się w spoczynku hLEC poprzez pomiar bakteryjnego CFU. Przeciwnie, aktywowane hLEC znacząco ograniczyły wzrost bakterii (Figura 2E). Nie wpłynęło to na żywotność komórek żywiciela, co zmierzono za pomocą testu uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (dodatkowa Figura 3A) lub przez uwalnianie CFU do supernatantów (dodatkowa Figura 3B). Ponadto, obciążenie infekcją było słabo skorelowane z powierzchnią hLEC (Supplemental Figure 3C). Co godne uwagi, M. tuberculosis rosła bardziej efektywnie w hLEC niż w ludzkich pierwotnych makrofagach zakażonych w porównywalnych warunkach (Supplemental Figure 3D). W spoczynku hLEC, M. tuberculosis wykazywał skłonność do wzrostu jako duże agregaty (rysunek 2D); w związku z tym zracjonalizowaliśmy fakt, że wewnątrzkomórkowe wartości CFU muszą nie doceniać całkowitej liczby bakterii, ponieważ każdy agregat M. tuberculosis może dać tylko kilka CFU (dane nie przedstawione). Aby przezwyciężyć ten problem, stworzyliśmy system oparty na obrazie, który był szeroko stosowany do ilościowego oznaczania wzrostu prątków u danio pręgowanego (26, 27) w celu ilościowego oznaczenia wzrostu M. tuberculosis za pomocą pikseli fluorescencyjnych. Kiedy określono sumę wszystkich pikseli EGFP na komórkę (pierwotna gęstość zintegrowana) jako miarę wzrostu bakterii (Figura 2F), ponownie potwierdzono za pomocą tego podejścia, że M. tuberculosis wzrastał w spoczynkowych hLEC i IFN-y. aktywacja ograniczyła ten wzrost. Następnie użyliśmy tej metody do ilościowego oznaczenia wzrostu bakterii w pozostałej części badania. Region RD1 jest ważny dla wewnątrzkomórkowego wzrostu M. tuberculosis w komórkach nabłonkowych i makrofagach in vitro (10, 12), przetestowaliśmy więc rolę tego regionu genomowego w hLEC (Figura 2G). M. tuberculosis H37Rv-aRD1-EGFP (określany dalej jako M. tuberculosis . RD1) wzrastał wolniej i miał znacznie zmniejszony wzrost na komórkę w porównaniu z M. tuberculosis WT w hLECs, natomiast M. tuberculosis H37Rv-ARD1 :: RD1. -EGFP (zwany dalej M. tuberculosis. RD1: comp) częściowo uzupełniał ten efekt. IFN-. znacząco ograniczyły wzrost M. tuberculosis. RD1 i M. tuberculosis. RD1: comp w 72 godziny po zakażeniu. Łącznie dane te pokazują, że hLEC in vitro może skutecznie internalizować prątki, a MR przyczynia się do tego procesu. Ponadto M. tuberculosis rozmnaża się in vitro w hLECs w sposób zależny od RD1, a wzrost ten jest znacznie ograniczony przez IFN-y. M. tuberculosis jest zlokalizowany w cytosolu i autofagosomach w sposób zależny od RD1 u hLEC. W makrofagach M. tuberculosis przeważnie przebywa w aresztowanym fagosomie bez markerów lizosomalnych i uważa się, że ułatwia to przetrwanie (28). Obserwując zależne od IFN-. ograniczenie wzrostu M. tuberculosis po 48 godzinach od zakażenia, przeanalizowaliśmy związek bakterii w tym punkcie czasowym z markerami późnej endocytozy / lizosomu.
[przypisy: gimnazjum w lubaszu, pluskwy ugryzienia, omega kleszczów ]