trzydniówka gorączka

Rozróżniliśmy między bakteriami, które były w przedziałach związanych z błoną (fagosomem, autofagiem lub lizosomem) i tymi, które nie miały żadnej oczywistej granicznej membrany w cytosolu (patrz Metody) (Figura 3C i dodatkowa Figura 5B). Stosując stereologię do obliczenia odsetka bakterii w różnych lokalizacjach (Figura 3D), stwierdziliśmy, że w hLEC około 75% M. tuberculosis WT było obecnych w cytozolu 48 godzin po zakażeniu, podczas gdy M. tuberculosis. RD1 pozostawał całkowicie w błonowe przedziały. Fosfosolowa frakcja M. tuberculosis . RD1: comp wynosiła 50%, co wskazuje, że komplementacja była funkcjonalna w odniesieniu do lokalizacji cytozolowej. Co ważne, leczenie IFN-y nie zmieniły w znaczący sposób układu lokalizacji M. tuberculosis WT, chociaż RD1 M. tuberculosis częściej przebywał w późnych przedziałach endosomalnych / lizosomalnych w 48 godzin po zakażeniu. W sumie tylko niewielka część WT M. tuberculosis zlokalizowana w późnych przedziałach endocytowych, w komórkach spoczynkowych lub aktywowanych IFN-ą. Przeciwnie, mutant RD1 M. tuberculosis . był głównie zlokalizowany w fagolizosomach w obu warunkach. Doszliśmy do wniosku, że u hLEC M. tuberculosis jest zlokalizowany w cytozolu 48 godzin po zakażeniu w sposób zależny od RD1. Ponadto obecność WT z M. tuberculosis w autofagosomach była zależna od RD1, ponieważ M. tuberculosis . RD1 nigdy nie znaleziono w tych organellach. Autopagulacja indukowana przez M. tuberculosis i lokalizacja w autofagosomach jest zależna od RD1. Biorąc pod uwagę, że autofagia jest mechanizmem pośredniczonym przez IFN-., który kontroluje wewnątrzkomórkowe prątki w makrofagach (30) i że cytozolowe prątki mogą być celowane w autofagosomy (31), badaliśmy, czy ten szlak indukowano w hLEC. Liczba punktów LC3 była istotnie wyższa po IFN-y stymulacja w ciągu 48 godzin (dodatkowa Figura 6A), spierająca się o indukcję autofagii i tworzenie autofagosomów. Infekcja hLEC za pomocą M. tuberculosis WT doprowadziła do akumulacji LC3-II w sposób zależny od RD1, chociaż całkowite poziomy były podobne w komórkach spoczynkowych i aktywowanych (Figura 4A). Spodziewaliśmy się, że poziomy LC3-II będą wyższe w komórkach traktowanych IFN-,, ale sama LC3-II jest zdegradowana przez autofagię, co może maskować ten efekt. Uzupełnienie regionu RD1 głównie przywróciło akumulację LC3-II. Podobnie, białko adaptacyjne autofagii p62 nagromadziło się po zakażeniu WT M. tuberculosis w sposób zależny od RD1 (Figura 4B). Całkowite poziomy białka p62 zmniejszono o około 30% do 40% po IFN-a. leczenie (dodatkowa Figura 6B), zgodne z wywołaną autofagią degradacją p62 (32). Analizując związek LC3 z M. tuberculosis za pomocą mikroskopii konfokalnej (rysunek 4, C i D), potwierdziliśmy, że celowanie autofagiczne jest ściśle zależne od RD1. W 48 godzin po zakażeniu związek LC3 z WT z M. tuberculosis w spoczynku hLEC był stosunkowo niski (8,4%, n = 3,391), podczas gdy IFN-y. leczenie znacząco zwiększyło związek LC3 z bakteriami (13,6%, n = 3 309) (Figura 4D) w porozumieniu z wynikami EM (Figura 3D). Zgodnie z oczekiwaniem, związek LC3 z M. tuberculosis. RD1 był prawie nieobecny (1,22%, n = 1810), podczas gdy związek LC3 z M. tuberculosis. RD1: comp był nieznacznie podwyższony w porównaniu z udziałem M. tuberculosis. Szczep RD1 (4,6%, n = 1826), zgodny z częściową, chociaż funkcjonalną, komplementarnością regionu RD1. Rycina 4. Indukcja autofagii przez M. tuberculosis i lokalizacja w autofagosomach zależą od RD1. (A) Western blot i oznaczanie ilościowe całkowitego poziomu białka całkowitego LC3-II w 48 godzin po zakażeniu (znormalizowane do aktyny) w niezakażonym, M
[patrz też: oparzenia pierwsza pomoc, ph metria, omega kleszczów ]